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無錫組織PCR檢測技術設計公司

來源: 發布時間:2023-02-09

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析:定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分,即待檢測成分有無的分析。通常,定性分析可以應用于病毒以及病原菌的檢測,物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測,如SARS、H1N1病毒,都可以通過Real-time PCR的方法進行高靈敏度的檢測,定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國家的一些檢驗檢疫機構,想要檢測進口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分,或者用于檢測羊奶中是否會摻有牛奶等等,可以通過Real-time PCR的方法進行檢測。基因分型,如啤酒型,肥胖型基因的檢測,就是Real-time PCR在基因分型方面的應用。聚合酶鏈式反應PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程。無錫組織PCR檢測技術設計公司

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引物的設計對于這個實驗至關重要,因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道,還有幾點必須注意:1,引物的錯配率(引物錯配形成引物二聚體,但是SYBR照樣能嵌入進去,結果導致實驗結果的誤差很大,重復性也不好)。2,引物的特異性一定要高(不像常規PCR,引物同源性不高,只要兩條產物的片段長度相差足夠大,在電泳的時候能夠區分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開,所以這就造成整個實驗結果誤差很大,不可信)。無錫組織PCR檢測技術設計公司PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。

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Real-time PCR操作流程:1、收集樣品。2相關試劑總RNA提取試劑TREzolReagent(RNA提取試劑),M-MLV(cDNA逆轉錄酶),RNA純化試劑,RealqPCRMasterMix(螢光定量PCR預混試劑)。3實驗儀器螢光定量PCR儀;PCR儀;低溫離心機。4總RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl);Real-time PCR操作流程:2µl隨機引物(T18,10pmol/ul);2µl10mMdNTPmix;加水至15µl體系。混勻后70℃變性RNA5分鐘,冰上速冷1分鐘,離心將溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer;1µlRNaseout;1µlM-MLVRT;加水至30µl體系。PCR儀中反應條件設定37℃延伸60min,70℃保溫15min終止反應。合成好的cDNA置于-20℃保存備用。

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。到2013年,PCR已發展到第三代技術。Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同,所以對引物的設計要求也不同。

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實時熒光定量PCR:實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。實時熒光定量PCR的定量方法,在Real-time PCR中,模板定量有兩種策略。無錫組織PCR檢測技術設計公司

PCR反應的特異性決定因素為:引物與模板DNA特異正確的結合。無錫組織PCR檢測技術設計公司

Real-time PCR鏈反應注意事項:在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂;為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照;內參的設定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;PCR不能進入平臺期,出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數,均應通過單獨實驗來確定;防止DNA的污染:采用DNA酶處理RNA;在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。無錫組織PCR檢測技術設計公司

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