對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經網絡，該網絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經元活動與行為聯系起來，需要同時監控非常龐大且分布普遍的神經元的活動，大腦中的神經網絡會在幾十毫秒內處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經元動力學，就需要MPM具備對神經元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。多光子顯微鏡的分辨率比傳統的單光子共聚焦要低的多。飛秒激光多光子顯微鏡暗場成像

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術或電可調諧透鏡（ETL）已經實現了快速軸向掃描；但是，遠程聚焦中反射鏡的機械驅動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球面像差和更高階像差，從而無法進行高分辨率成像。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學設計，能將橫向掃描轉換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描。該設計有兩種實現方式，第一種能夠執行離散的軸向掃描，另一種能夠進行連續的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示，由兩個垂直臂組成，每個臂中都有一個4F望遠鏡和一個物鏡。遠程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1），另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構成。將這兩個臂對齊，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直的激光束被偏振分束器反射到遠程聚焦臂中，GSM對其進行掃描，進而使得OBJ1產生的激光焦點進行橫向掃描。飛秒激光多光子顯微鏡峰值功率密度多光子顯微鏡可以更好的了解神經信號之間復雜動態的編碼過程。

    與傳統的單光子寬場熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡(MPM)具有光學切片和深度成像的功能，極大地促進了研究人員對整個大腦深部神經的認識。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經元成像、大數量神經元成像、高速神經元成像三個方面討論了相關的MPM技術。為了將神經元活動與復雜行為聯系起來，通常需要對大腦皮層深處的神經元進行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力。激發光和發射光會被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強度可以解決散射問題，但會帶來其他問題，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發光。另外，對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發的相同強度的熒光信號。

ＳｔｅｒｎａｎｄＪｅａｎＭａｒｘ在評論中說：祖家能夠在更為精細的層次研究樹突的功能，這在以前是完全不可能的。新的技術（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計算和神經信號處理中的作用有了更好的理解。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性，及其獨特的電、及其獨特的電化學特征使神經元完成了一系列的專門任務。雙光子與共聚焦在發育生物學中的應用雙光子∶ 每2.5分鐘掃描一次，觀察24小時，發育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次，觀察8小時后細胞分裂停止，不能發育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發時的細胞存活率為多光子系統的10～20%。雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率。

    基于多光子顯微鏡的神經成像技術原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結構與共焦類似，區別在于：1)雙光子顯微鏡的激發光波長比共焦長，能量較低，但穿透能力較強；2)雙光子顯微鏡沒有小孔，提高了檢測效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優勢呢？原因是它采用雙光子激發方式。使用波長較長的激發光子，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個這樣的激發光子才能達到激發態，從而釋放出一個熒光光子。因此，熒光信號的強度與光強的平方成正比。因為焦點處的光強較大，只能在焦點處激發熒光。波長越長，穿透力越強，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡。由于兩個光子只在焦點激發熒光，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來，提高了檢測效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡，利用三個激發光子可以實現更深的成像深度。由于使用了更長的激發波長，穿透能力更強，成像深度更大。此外，由于較強的非線性效應，熒光信號的強度與光強的立方成正比，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發和背景噪聲。 顯微鏡產品正拉動市場需求，多光子顯微鏡市場發展潛力巨大。美國進口多光子顯微鏡層析成像

4tune光譜檢測器，實現多光子顯微鏡的光譜型檢測。飛秒激光多光子顯微鏡暗場成像

比較兩表格中的相關參數可以看出，基于分子光學標記的成像技術已經在生物活檢和基因表達規律方面展示了較大的優勢。例如，正電子發射斷層成像（PET）可實現對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數種類與時空分辨率方面有一定優勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術可以實現小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發的顯微成像技術可望實現小鼠體內基因表達的實時在體成像。飛秒激光多光子顯微鏡暗場成像