快速光柵掃描有多種實現方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描，但可調電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現可使用空間光調制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調控M的位置實現軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。世界多光子激光掃描顯微鏡產業主要布局在德國和日本，德國是徠卡顯微系統和蔡司。美國嚙齒類多光子顯微鏡Ultima Investigator

多光子激發在紫外成像的優勢在可見光脈沖中能得到紫外衍射的顯微觀察像。即使不使用紫外域光源、光學元件用可見光源、光學元件就能得到紫外光激勵的高空間分辨率圖像。多光子在生物成像中的優勢在生物顯微鏡觀察方面，較早考慮的是不損壞生物本身的活性狀態，維持水分、離子濃度、氧和養分的流通。在光觀察場合，無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細胞不受損傷的照射量、光能量內。多光子顯微鏡則能夠滿足此，而且還具有很多優點。如三維分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面，均有以往激光顯微鏡不具備，或具有無法比擬的超越特性。美國嚙齒類多光子顯微鏡系統使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。

多光子激發的特點。激發波長∶兩個或多個光子同時激發，激發波長是單光子激發波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發UV探針）。多光子激發∶依賴于多個光子同時到達的時間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16 seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產生多光子吸收。熒光強度正比于（激光強度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實現三光子激發。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發光源處于近紅外區，對細胞毒性和光漂白更小。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術或電可調諧透鏡（ETL）已經實現了快速軸向掃描；但是，遠程聚焦中反射鏡的機械驅動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球面像差和更高階像差，從而無法進行高分辨率成像。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學設計，能將橫向掃描轉換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描。該設計有兩種實現方式，第一種能夠執行離散的軸向掃描，另一種能夠進行連續的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示，由兩個垂直臂組成，每個臂中都有一個4F望遠鏡和一個物鏡。遠程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1），另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構成。將這兩個臂對齊，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直的激光束被偏振分束器反射到遠程聚焦臂中，GSM對其進行掃描，進而使得OBJ1產生的激光焦點進行橫向掃描。多光子顯微鏡的大多數補償器都采用棱鏡。

雙光子熒光顯微成像主要有以下優點∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發光，對細胞和組織的光損傷很小，適合于長時間的研究;b.穿透能力強∶相對于紫外光，可見光或近紅外光具有很強的穿透性，可以對生物樣品進行深層次的研究;c．高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為λ范圍內;d.漂白區域很小，焦點以外不發生漂白現象。e．熒光收集率高。與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器，提高了熒光收集率。收集效率提高直接導致圖像對比度提高。f.對探測光路的要求低。由于激發光與發射熒光的波長差值加大以及自發的三維濾波效果，多光子顯微鏡對光路收集系統的要求比單光子共焦顯微鏡低得多，光學系統相對簡單。g.適合多標記復合測量。許多染料熒光探針的多光子激發光譜要比單光子激發譜寬闊，這樣，可以利用單一波長的激發光同時激發多種染料，從而得到同一生命現象中的不同信息，便于相互對照、補充。多光子顯微鏡在基礎科學和臨床診斷領域的應用范圍正在持續增長。美國布魯克多光子顯微鏡長時間觀察

多光子顯微鏡的分辨率比傳統的單光子共聚焦要低的多。美國嚙齒類多光子顯微鏡Ultima Investigator

光學成像技術與分子生物學技術的結合為研究上述科學問題提供了條件與可能。因此，在現代分子生物學技術基礎上，急需發展新的成像技術。在動物體內，如何實現基因表達及蛋白質之間相五作用的實時在體成像監測是當前迫切需要解決的重大科學技術問題。這是也生物學、信息科學（光學）和基礎臨床醫學等學科共同感興趣的重大問題。對這-一一科學問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規律、認識疾病的發展規律，而且對創新藥物研究、藥物療效評價以及發展疾病早期診斷技術等產生重大影響。美國嚙齒類多光子顯微鏡Ultima Investigator