目前，腦科學的研究在全球范圍內(nèi)如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動。其中，全景式分析腦連接圖和功能動態(tài)圖的研究成為重點研究方向，如何打破尺度壁壘，將微觀神經(jīng)元和突觸的信息處理和個體行為信息與全腦融合，是該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學分子醫(yī)學研究所牽頭，北京大學信息科學與技術(shù)學院電子系、工程學院和中國人民醫(yī)學科學院組成的跨學科團隊在NatureMethods上在線發(fā)表了一篇題為《大視場、多平面、長程腦成像的微型雙光子拷貝》的文章。本文報道了第二代小型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0。其成像視場是團隊2017年發(fā)布的第1代小型化顯微鏡的7.8倍。同時具有三維成像能力，獲得了小鼠自由運動行為時大腦三維區(qū)域數(shù)千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，實現(xiàn)了對同一批次神經(jīng)元一個月的跟蹤記錄。雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學操縱。國外ultima雙光子顯微鏡成像視野

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發(fā)明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復(fù)率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經(jīng)成為雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。進口雙光子顯微鏡成像視野一般是多少雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而能夠達到逐點掃描的效果。

從雙光子到三光子：科學家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。國外ultima雙光子顯微鏡成像視野

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?國外ultima雙光子顯微鏡成像視野

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。國外ultima雙光子顯微鏡成像視野