雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，可以在保持細胞活性的情況下，對深層組織進行高分辨率成像。它主要用于生物學、醫學和材料科學等領域的研究。雙光子顯微鏡的重心技術是基于雙光子激發的熒光成像。當激光通過樣品時，它會吸收特定波長的光子，然后發出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個連續的光子同時激發樣品，這樣可以在保持樣品完整性的同時，獲得高質量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優點：1.高分辨率：由于雙光子激發的特性，它可以獲得比傳統顯微鏡更高的分辨率。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制，傳統的光學顯微鏡無法對深層組織進行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個問題，因為它可以激發樣品的深層熒光。3.活細胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細胞活性的情況下進行成像，這對于研究細胞生理學和生物化學過程非常有用。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結合多種技術，如光譜成像、鈣離子成像和神經活動成像等，以提供更豐富的生物樣品信息。總之，雙光子顯微鏡是一種強大的研究工具，可以對深層組織和活細胞進行無損成像。這使得它在生物學、醫學和材料科學等領域的研究中具有廣泛的應用。雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。國內bruker雙光子顯微鏡光損傷

有了雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡可以發揮更好的作用。那么，什么是雙光子激發技術呢？在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，使電子躍遷到更高的能級。短時間后，電子跳回到較低的能級，發出波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理，雙光子激發技術誕生了。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光通過物鏡會聚。由于雙光子激發需要很高的光子密度，物鏡焦點處的光子密度比較高，所以雙光子激發只能發生在焦點處產生熒光，該點產生的熒光穿過物鏡，被光學探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。美國激光雙光子顯微鏡磷光壽命計數雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；

生物樣品的三維觀察是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術有光學顯微鏡、點陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡)。其中，激光掃描顯微鏡利用轉盤可以進行多焦點激光掃描，提高了時間分辨率，有利于減少活細胞成像中的光損傷。本文主要實現可見光雙光子激發和多焦點激光掃描的結合，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對比度，這也是可見光雙光子激發(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應用。

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優勢？它能做普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細胞的毒性。此外，由于雙光子激發效應只能發生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發光效率，減少掃描點以外的熒光物質的消耗。成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調焦設備。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡角膜成像。美國雙光子顯微鏡ultimainvestigator

雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監測。國內bruker雙光子顯微鏡光損傷

臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統介紹及其在臨床醫療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩定的動態信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。國內bruker雙光子顯微鏡光損傷