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國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術

來源: 發布時間:2024-10-26

通過并行化不同激光波長的激光掃描,研究人員增加了在相同時間內可以成像的體積,同時保持了高的時間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針,將神經元群體的活動標記為兩種不同的顏色,同時激發兩種不同波長的探針,從而實現了兩種顏色的并行數據記錄。為了實現三維空間成像,研究人員還在兩個激光束上配置了快速變焦系統,即一個電透鏡和一個空間光調制器。因此,可以以10Hz的速度同時記錄10個500微米和500微米的平面,覆蓋600微米的深度,覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結構,體積內可以記錄2000多個神經元。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術

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隨著技術的發展,雙光子顯微鏡的性能不斷優化。結合其特點,大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發激光進入更深的層次,可以從器件優化和標本改造兩個方面入手。關于器件的優化,我們可以把激光束做得更細,集中能量,讓激光穿透得更深。對于樣品,物質的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題,我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質浸泡標本,使其中的物質(主要是脂質)被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類,從而提高標本的“透明度”。bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡有這么多優點,那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢?

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第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,其成像視野是該團隊于2017年發布的代微型化顯微鏡的7.8倍,同時具備三維成像能力,獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區域內上千個神經元清晰穩定的動態功能圖像,并且實現了針對同一批神經元長達一個月的追蹤記錄。在一批“早鳥項目”中,該系統已被多個研究組應用于不同的模式動物和行為范式,如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調控后大腦特定神經元變化、新型神經遞質乙酰膽堿探針的傳導適應性分析以及獼猴三腦區成像等多項研究。

配合雙光子激發技術,激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么,什么是雙光子激發技術呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,經過一個很短的時間后,電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發需要很高的光子密度,而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點處才能發生雙光子激發,產生熒光,該點產生的熒光再次穿過物鏡,被光探頭接收,從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,是通過物鏡匯聚的。

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像差問題一直困擾著光學領域的工作者。像差會使光波前發生形變,不僅降低成像的信噪比和分辨率,使得很多時候我們只能“霧里看花”,更甚者,產生贗像,或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴重,因為在那里,熒光信號對入射光強度的依賴是平方關系,一旦入射光波前形變,不僅聚焦強度大幅下降,成像分辨率也急劇惡化。因此,如何解決像差問題,實現,例如小鼠大腦皮層,深層區域的高質量成像成為光學成像發展中相當有挑戰性的問題之一。雙光子顯微鏡的原理是什么?國外2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察!國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術

首先,雙光子成像采用波長范圍約在700~1000 nm的近紅外光激發,在組織中的散射系數較小,穿透性很好,因此非常適合厚樣本的觀察。同時,由于是近紅外光激發,也能避免樣品中激發波長較短的自發熒光物質的干擾,可獲得較強的熒光信號(如下圖)。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達200~500 μm,能夠較好地進行三維成像。雙光子成像的另一大優勢在于精確的空間點聚焦性。一般條件下,物質只會被單光子激發,只有在光子密度足夠高的情況下,物質才會吸收兩個光子從而被激發,所以,雙光子只會在光子密度蕞高的物鏡焦點附近發生,很少產生焦平面外的雜散光(如下圖)。這種性質既提高了成像質量,也降低了樣本的光漂白、光損傷區域。基于這些優勢,使得雙光子顯微鏡非常適合對活細胞、活組織進行長時間在體成像。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術

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