隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點(diǎn)，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進(jìn)。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細(xì)，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標(biāo)本的“透明度”。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。美國雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。

臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。

在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。美國雙光子顯微鏡光刺激

通過對顯微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴(kuò)展至420×420平方微米，顯微物鏡的工作距離擴(kuò)展至1mm，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊，實(shí)現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時成像。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定。其中，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自由拆卸。此外，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長時間實(shí)驗(yàn)對動物的干擾。反復(fù)裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。美國雙光子顯微鏡光刺激