在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發時，在波長為350nm光的激發下發出450nm熒光；而在雙光子激發時，可采用750nm的激發光得到450nm熒光。由于雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。由于其非侵入性和高分辨率的特點，雙光子顯微鏡成為了研究神經科學、ai癥研究、免疫學等領域的重要工具。雙光子顯微鏡商家

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發體積小，具有定點激發的特性，具有更少的光毒性；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，能夠更加安全。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡優勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術相結合的新技術。雙光子激發的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，經過短暫的所謂激發態壽命后，發射一個波長較短的光子；效果和用波長為長波長一半的光子激發熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優點是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區域；因為信號背景比高，所以具有更高的對比度；由于激發體積小，具有定點激發、光毒性小的特點；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，更加安全。

雙光子顯微鏡的優勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發熒光。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發熒光的主要優勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡將得到更大的發展與更廣的應用。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發熒光。雙光子激發熒光的主要優勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個光子的能量相加達到熒光激發能量閾值，來激發樣品中熒光分子發出熒光信號。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡

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首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術，是熒光顯微成像的一種，用于激發樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發光照射，縱然焦平面外也有激發光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發光波長較長，只有當兩個（或更多）激發光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡商家