因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率。由于光的波長有限，光子顯微鏡的分辨率受到限制，無法觀察到更小的結構和細胞器。美國靈長類多光子顯微鏡多光子激發

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。美國多光子顯微鏡作用高精度，低光損，多光子顯微鏡為科研提供準確依據。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術或電調諧透鏡(ETL)已經實現了快速軸向掃描。但遠程對焦時對反射鏡的機械驅動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學設計，可以將橫向掃描轉換為無球面像差的軸向掃描，以實現高分辨率成像。有兩種方法可以實現這種設計。***個可以執行離散的軸向掃描，另一個可以執行連續的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個垂直臂組成，每個臂具有4F望遠鏡和物鏡。遠程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直后的激光束經偏振分束器反射進入遠程聚焦臂，由GSM進行掃描，使OBJ1產生的激光焦點可以進行水平掃描。

有許多方法可以實現快速光柵掃描，例如使用振鏡進行快速2D掃描，以及將振鏡與可調電動透鏡相結合進行快速3D掃描。而可調電動式鏡頭由于機械慣性的限制，無法在軸向快速切換焦點，影響成像速度。現在它可以被空間光調制器(SLM)取代。遠程對焦也是實現3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調整M的位置實現軸向掃描該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動以進行快速軸向掃描，因此大FOV系統依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。多光子顯微鏡是一款針對厚樣本進行深層成像的利器,特別是在實驗中。

當激光光束焦點的位置在鏡面上，此時被反射的激光在無限空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會形成遠離傾斜鏡鏡面的焦點，這又導致返回的光束會聚或發散，進而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點，通過這種方式即能實現連續的軸向掃描。對于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實驗中表征了這種將橫向掃描轉換為軸向掃描技術的光學性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數量級，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進行共振遠程聚焦，該技術可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學進行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。多光子顯微鏡-適用于各行各業的觀察需求。美國高速高分辨率多光子顯微鏡數據處理

與傳統的熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有更好的深度穿透能力和較低光損傷性，可以觀察更深層的組織結構。美國靈長類多光子顯微鏡多光子激發

光學成像技術與分子生物學技術的結合為研究上述科學問題提供了條件與可能。因此，在現代分子生物學技術基礎上，急需發展新的成像技術。在動物體內，如何實現基因表達及蛋白質之間相五作用的實時在體成像監測是當前迫切需要解決的重大科學技術問題。這是也生物學、信息科學（光學）和基礎臨床醫學等學科共同感興趣的重大問題。對這-一一科學問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規律、認識疾病的發展規律，而且對創新藥物研究、藥物療效評價以及發展疾病早期診斷技術等產生重大影響。美國靈長類多光子顯微鏡多光子激發