與傳統的單光子寬場熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡(MPM)具有光學切片和深度成像的功能，極大地促進了研究人員對整個大腦深部神經的認識。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經元成像、大數量神經元成像、高速神經元成像三個方面討論了相關的MPM技術。為了將神經元活動與復雜行為聯系起來，通常需要對大腦皮層深處的神經元進行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力。激發光和發射光會被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強度可以解決散射問題，但會帶來其他問題，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發光。另外，對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發的相同強度的熒光信號。 全球多光子顯微鏡主要廠商基本情況介紹，包括公司簡介、多光子顯微鏡產品型號、產量、產值及動態等。布魯克多光子顯微鏡成像精度

比較兩表格中的相關參數可以看出，基于分子光學標記的成像技術已經在生物活檢和基因表達規律方面展示了較大的優勢。例如，正電子發射斷層成像（PET）可實現對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數種類與時空分辨率方面有一定優勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術可以實現小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發的顯微成像技術可望實現小鼠體內基因表達的實時在體成像。進口多光子顯微鏡成像分辨率多光子顯微鏡的發展現狀及未來發展趨勢。

多束掃描技術可以同時對神經元組織的不同位置進行成像該技術：對兩個遠距離（相距大于1-2 mm）的成像部位，通常使用兩條單獨的路徑進行成像；對于相鄰區域，通常使用單個物鏡的多光束進行成像。多光束掃描技術必須特別注意激發光束之間的串擾問題，這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串擾；時空復用方法指的是同時使用多個激發光束，每個光束的脈沖在時間上延遲，這樣就可以暫時分離被不同光束激發的單個熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經元進行成像，但是多路光束會導致熒光衰減時間的重疊增加，從而限制了區分信號源的能力；并且多路復用對電子設備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比，這會容易導致組織損傷。

快速光柵掃描有多種實現方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描，但可調電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現可使用空間光調制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調控M的位置實現軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細胞的形態、生理學研究。

   多光子顯微鏡的前景巨大 作為一個多學科交叉、知識密集、資金密集的高技術產業，多光子顯微鏡涉及醫學、生物學、化學、物理學、電子學、工程學等學科，生產工藝相對復雜，進入門檻較高，是衡量一個國家制造業和高科技發展水平的重要標準之一。過去的5年，多光子顯微鏡市場集中，由于投產生產的成本較高，技術難度大，目前涌現的新企業不多。顯微鏡作為一個傳統的高科技行業，其作用至今沒有被其他技術顛覆，只是不斷融合并發展相關技術，在醫療和其他精密檢測領域發揮著更大的作用。顯微鏡的商業化發展已進入成熟期，主要需求來自教學、生命科學的研究及精密檢測等，全球市場呈現平緩的增長態勢。然而，**、、顯微鏡產品（如多光子顯微鏡、電子顯微鏡）正拉動市場需求，多光子顯微鏡市場發展潛力巨大。 多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術中。還有其他類型的圖像對比提供有關樣本的有價值信息。嚙齒類多光子顯微鏡焦點激發

從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統稱為多光子顯微鏡。布魯克多光子顯微鏡成像精度

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術或電可調諧透鏡（ETL）已經實現了快速軸向掃描；但是，遠程聚焦中反射鏡的機械驅動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球面像差和更高階像差，從而無法進行高分辨率成像。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學設計，能將橫向掃描轉換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描。該設計有兩種實現方式，第一種能夠執行離散的軸向掃描，另一種能夠進行連續的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示，由兩個垂直臂組成，每個臂中都有一個4F望遠鏡和一個物鏡。遠程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1），另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構成。將這兩個臂對齊，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直的激光束被偏振分束器反射到遠程聚焦臂中，GSM對其進行掃描，進而使得OBJ1產生的激光焦點進行橫向掃描。布魯克多光子顯微鏡成像精度