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HMGB1免疫熒光染色

來源: 發布時間:2023-10-21

免疫熒光的原理和類型:免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長(分子的吸收光譜)下吸收光子的特性,經過短暫的間隔(發射光譜)后以較高的波長發射光子,并伴隨能量損失。發射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發。具有高光穩定性和熒光量子產率的熒光染料可在市場上購買,其激發較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞,可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時,首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時,熒光團與目標抗原的抗體結合,然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據使用的抗體和所需的信號擴增,免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術可以用于研究細胞分裂和細胞周期。HMGB1免疫熒光染色

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細胞的固定及免疫熒光:注意事項:(1)取細胞爬片時,動作應輕柔,防止將細胞爬片夾碎,影響實驗進程。(2)種細胞過程中,要注意將細胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細胞局部生長過密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過程中注意避光。(4)細胞爬片進行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內,暫時保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進行熒光顯微鏡拍照時,要根據熒光抗體選擇合適的激發光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。HMGB1免疫熒光染色免疫熒光技術可以用于研究細胞遷移和細胞黏附。

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熒光的產生:一此化學物質能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能等)而進入激發態,當其從激發態再回復到基態時,過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發光)。熒光發射的特點是:可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發光;而一旦停止供能,發光(熒光)現象也隨之在瞬間內消失。可以引起發熒光的能量種類很多,由光激發所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光,由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。

細胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎。細胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現用現配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過夜(找個小瓶蓋將小玻片支起來,抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻。抗體稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘。抗體稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關鍵阿,多封幾次才有體會。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術可以用于研究細胞信號傳導和信號通路。

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細胞免疫熒光實驗注意事項:非特異性染色:是否滅活內源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復過度。染色過深:一抗濃度過高;染色試濃度過高或孵育時間過長;染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設陰性對照組,消除由于抗體非特異性結合而產生的背景染色;選擇醛類固定液時,保持其新鮮度,較好現配現用,使用不新鮮的醛類固定液自發熒光背景會升高。免疫熒光技術可以用于研究細胞內蛋白質的定位和表達水平。S100 beta免疫組化IHC

免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術,用于檢測和定位特定抗原或抗體。HMGB1免疫熒光染色

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項:1)熒光染色后一般在1h內完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長,會使熒光減弱。2)每次試驗時,需設置以下三種對照:①陽性對照:陽性血清+熒光標記物②陰性對照:陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照:PBS+熒光標記物3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物,應始終保持在已知抗原標本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。HMGB1免疫熒光染色

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